玉研香煙染毒系統(tǒng) | 自動(dòng)、靈活、安全建立香煙暴露小鼠模型——助力慢阻肺的病理研究

慢性阻塞性肺疾?。璺?，COPD）是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和（或）肺氣腫，可進(jìn)一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭的常見慢性疾病。其致殘率和病死率居高不下，全球40歲以上人群中的發(fā)病率已高達(dá)9%～10%，嚴(yán)重危害著人們的健康。

慢阻肺以持續(xù)氣流受限為特征，這種氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。氣流受限和氣道阻塞作為該疾病最重要的病理生理改變，其確切病因尚不完全明了，但普遍認(rèn)為是由個(gè)體易患因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。許多患者還常常伴隨其他有臨床癥狀的慢性病，這無疑增加了慢阻肺的發(fā)病率和病死率。

在探討慢阻肺的病因時(shí)，我們不得不提的是吸煙這一最常見和最主要的危險(xiǎn)因素。長期吸煙不僅直接損害呼吸道，還可能導(dǎo)致職業(yè)性粉塵和化學(xué)氣體等其他有害物質(zhì)的吸入風(fēng)險(xiǎn)增加，從而加劇慢阻肺的發(fā)生。香煙中的有害物質(zhì)通過誘導(dǎo)氣道上皮炎癥反應(yīng)，破壞上皮屏障，促進(jìn)免疫細(xì)胞的聚集，并導(dǎo)致粘液分泌過多和小氣道壁的重塑。

近期，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院肺病危重癥醫(yī)學(xué)科張靜教授團(tuán)隊(duì)在國際權(quán)威期刊上Free Radical Biology and Medicine發(fā)表一篇題為“ROS induced the Rab26 promoter hypermethylation to promote cigarette smoking-induced airway epithelial inflammation of COPD through activation of MAPK signaling”的文章。他們發(fā)現(xiàn)，香煙暴露會(huì)導(dǎo)致肺組織的表觀遺傳改變，這種改變與慢阻肺的慢性炎癥緊密相關(guān)。其中，DNA甲基化作為控制表觀遺傳轉(zhuǎn)錄的主要方式，在吸煙影響下的變化尤為關(guān)鍵。吸煙通過調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，進(jìn)而影響到慢阻肺的發(fā)病過程。

此外，研究還揭示了香煙暴露下氣道炎癥反應(yīng)的更深層次機(jī)制。香煙產(chǎn)生的活性氧（ROS）在這一過程中扮演著重要角色。ROS不僅調(diào)節(jié)DNMTs的表達(dá)，還影響到p53和Bcl2的功能，最終導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞的凋亡。盡管ROS在調(diào)控基因甲基化/去甲基化過程中的具體機(jī)制尚不完全清楚，但這一發(fā)現(xiàn)無疑為我們理解慢阻肺的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。

值得一提的是，Rab蛋白作為調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要分子，在肺部炎癥中也發(fā)揮著不可忽視的作用。特別是Rab26，它被發(fā)現(xiàn)能夠抑制炎癥信號，減弱肺內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。然而，在香煙暴露后，Rab26的作用機(jī)制及其與氣道炎癥的關(guān)系仍待進(jìn)一步揭示。

這項(xiàng)研究不僅深化了我們對慢阻肺發(fā)病機(jī)制的理解，也為未來的治療提供了新的思路。通過深入研究ROS和Rab26等分子在氣道炎癥反應(yīng)中的作用，我們有望開發(fā)出更為有效的預(yù)防和治療策略，為慢阻肺患者帶來福音。

文中提到，在卷煙暴露條件下，ROS通過促進(jìn)DNMT3b介導(dǎo)的Rab26啟動(dòng)子DNA甲基化來抑制Rab26的表達(dá)，下調(diào)Rab26的表達(dá)可增強(qiáng)p38和JNK MAPK信號的激活，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生；NAC（N-乙酰半胱胺酸）恢復(fù)Rab26也可減輕香煙暴露誘導(dǎo)的氣道上皮炎癥反應(yīng)

研究者首先建立了香煙暴露小鼠模型，使用全身香煙煙霧暴露系統(tǒng)，將小鼠（n = 5）暴露于20支香煙中，每天兩次，每周6天，持續(xù)2小時(shí)，持續(xù)三個(gè)月。對照組（n = 5）保持在相同的環(huán)境中，包括相同的食物量，不接觸香煙。全身香煙煙霧暴露系統(tǒng)由上海玉研儀器提供，配備全自動(dòng)香煙煙霧發(fā)生器、暴露箱體和層流生物安全柜。為避免操研究者接觸二手煙，暴露箱體設(shè)置在層流生物安全柜內(nèi)，香煙由自動(dòng)香煙煙霧發(fā)生器產(chǎn)生，并被泵入暴露箱。隨后采集小鼠肺和支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行H&E染色、免疫組化（IHC）和炎癥介質(zhì)測定。同時(shí)測定小鼠的體重、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、Hct和HbCO水平。

香煙暴露誘導(dǎo)氣道上皮炎癥反應(yīng)

香煙暴露染毒的氣道炎癥反應(yīng)是COPD的一個(gè)主要特征。在此，研究者評估了體內(nèi)和體外香煙暴露氣道上皮的炎癥反應(yīng)。H&E染色顯示，香煙暴露小鼠氣道上皮結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管周圍出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞（圖.1A）。此外，肺泡空間擴(kuò)大和破壞（圖.1A）。病理改變與吸煙相關(guān)的COPD和肺氣腫一致。全身香煙暴露小鼠的全身性炎癥水平也被評估。與對照組相比，全身暴露小鼠的BALF IL-8和IL-6水平顯著升高（圖.1B＆C）。

圖1.香煙暴露誘導(dǎo)體內(nèi)和體外炎癥反應(yīng)

香煙暴露抑制了Rab26在氣道上皮中的表達(dá)

數(shù)據(jù)顯示，在COPD患者的樣本中，肺組織中Rab26水平的PKM明顯低于非COPD患者（圖.2A）.IHC數(shù)據(jù)顯示，香煙暴露的小鼠的肺氣道上皮細(xì)胞中Rab26的表達(dá)低于對照組小鼠（圖.2B）.此外，與對照組相比，香煙暴露的小鼠肺組織中Rab26的表達(dá)降低（圖.2C）。

圖2.香煙暴露抑制了Rab26在體內(nèi)和體外的表達(dá)

DNMT3b調(diào)控Rab26的表達(dá)

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase， DNMT）家族成員在介導(dǎo)基因DNA甲基化中起關(guān)鍵作用。因此，研究者探索了DNTM3B在香煙暴露誘導(dǎo)的Rab26啟動(dòng)子DNA甲基化中的作用。研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3B在香煙暴露小鼠肺組織中的表達(dá)增加（圖.3A）。免疫組化分析還顯示，與對照組相比，香煙暴露組氣道上皮DNMT3B水平升高（圖.3B）。

圖3.Rab26抑制香煙暴露誘導(dǎo)的起到上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)

ROS通過調(diào)控DNMT3b抑制Rab26的表達(dá)

為了確認(rèn)ROS對Rab26表達(dá)的影響及其通過啟動(dòng)子甲基化的潛在機(jī)制，研究者將細(xì)胞用不同劑量的H₂O₂（一種ROS）處理2小時(shí)。數(shù)據(jù)顯示H₂O₂增加DNMT3B蛋白的產(chǎn)生，抑制Rab26的表達(dá)（圖.4E）。與上述結(jié)果一樣，NAC預(yù)孵育細(xì)胞后，H₂O₂存在下Rab26的下調(diào)表達(dá)得到部分恢復(fù)（圖.4F）。熒光素酶檢測顯示H₂O₂抑制Rab26啟動(dòng)子的活性（圖.4G）。這些數(shù)據(jù)表明，香煙暴露誘導(dǎo)的ROS抑制了Rab26啟動(dòng)子的活性，下調(diào)了Rab26的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。而NAC能部分逆轉(zhuǎn)香煙暴露對Rab26表達(dá)的抑制作用。

圖4.ROS通過調(diào)控DNMT3b抑制Rab26的表達(dá)

抗氧化劑增強(qiáng)Rab26表達(dá)，減輕COPD小鼠的炎癥反應(yīng)

體外實(shí)驗(yàn)顯示，香煙暴露誘導(dǎo)的氧化劑導(dǎo)致上皮細(xì)胞中Rab26的生成減少，炎癥增加，而NAC（N-乙酰半胱胺酸）是目前廣泛應(yīng)用于治療COPD患者。本研究通過NAC證實(shí)抗氧化劑對體內(nèi)Rab26表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，以及提高肺組織中Rab26表達(dá)對COPD小鼠炎癥反應(yīng)的影響。H&E顯示NAC改善了鰓周區(qū)域的炎癥細(xì)胞浸潤（圖.5A）。圖7B顯示，小鼠在香煙暴露期飲用NAC溶液后，Rab26表達(dá)升高，DNMT3b水平下降。同樣，與香煙暴露組相比，NAC/香煙暴露組肺氣道上皮中Rab26表達(dá)升高，DNMT3b表達(dá)降低（圖.5C）。此外，NAC處理抑制香煙暴露誘導(dǎo)的IL-8和IL-6的BALF水平（圖.5D＆E）。這些數(shù)據(jù)表明，ROS可能通過促進(jìn)DNMT3b介導(dǎo)的DNA甲基化和改善香煙暴露誘導(dǎo)的COPD小鼠炎癥反應(yīng)中Rab26的表達(dá)來抑制Rab26。

圖5.抗氧化劑增強(qiáng)了Rab26表達(dá)，減輕COPD小鼠的炎癥反應(yīng)

在構(gòu)建慢性阻塞性肺疾?。?/span>COPD）的動(dòng)物模型時(shí)，玉研儀器精心選擇了一些關(guān)鍵的造模參數(shù)，以確保模型的準(zhǔn)確性和可靠性。

首先，考慮到香煙暴露作為COPD發(fā)病的主要因素，因此需設(shè)定精確的香煙暴露條件。通過控制香煙煙霧的濃度、暴露頻率和持續(xù)時(shí)間，可以成功模擬出長期吸煙對肺組織的損害作用。

其次，為了模擬COPD患者肺部炎癥的復(fù)雜環(huán)境，引入了多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的刺激。這些介質(zhì)和因子的種類、濃度和作用時(shí)間均經(jīng)過精心調(diào)整，以最大程度地模擬COPD患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

此外，還需注重模擬COPD患者肺部氣流受限的特征。通過調(diào)整氣道阻力、肺順應(yīng)性和通氣功能等參數(shù)，可以成功構(gòu)建具有氣流阻塞特征的COPD模型。

在整個(gè)造模過程中，嚴(yán)格遵循科學(xué)原則，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。同時(shí)，研究者還需注重動(dòng)物福利和倫理原則，確保實(shí)驗(yàn)過程對動(dòng)物的傷害最小化。

通過這些精心設(shè)計(jì)的造模參數(shù)，可以成功構(gòu)建能夠真實(shí)反映COPD病理生理改變的動(dòng)物模型，為后續(xù)的研究提供了有力的工具：

1、僅用香煙暴露進(jìn)行小鼠造模：待小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境后，被隨機(jī)分配到四個(gè)組：對照組、PM2.5組、吸煙組和PM2.5+吸煙組，每組有7只小鼠。對照組小鼠僅暴露在室內(nèi)空氣，無PM2.5。PM2.5組小鼠通過超聲波霧化器吸入PM2.5（濃度為110 μg/m³）。吸煙組小鼠在香煙暴露染毒箱內(nèi)吸入香煙煙霧（在2.5小時(shí)內(nèi)消耗10支香煙）。PM2.5+吸煙組小鼠同時(shí)暴露于PM2.5和香煙煙霧中。暴露方式：所有小鼠每周5天，每天兩次接受上述處理，持續(xù)10個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，小鼠被處死，并收集肺組織進(jìn)行分析。

2、香煙暴露聯(lián)合氣道內(nèi)滴注脂多糖方法進(jìn)行造模：持續(xù)時(shí)間8周，除空白組外，其余各組小鼠置于自動(dòng)小動(dòng)物熏煙箱中，將香煙插入自動(dòng)點(diǎn)煙盒，點(diǎn)燃后打開微型真空泵，將煙霧引入暴露箱體中。每天進(jìn)行香煙暴露兩次，間隔3小時(shí)，每次點(diǎn)煙8支，煙霧最大濃度狀態(tài)維持30min。（備注：每次30min熏煙過程中可間隔15min適當(dāng)通入少量氧氣，警惕小鼠缺氧死亡）熏6天停1天，連續(xù)熏煙8周。在第1、14、21天用10%水合氯醛0.3ml/100g對各組小鼠進(jìn)行腹腔麻醉，后切開頸部皮膚，暴露氣管，空白組予0.2ml生理鹽水氣道內(nèi)注射，其余各組予濃度為1mg/ml的脂多糖0.2ml氣管注射（注射當(dāng)日不熏煙）。

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EMMSLink WBP清醒動(dòng)物全身體積描記系統(tǒng)為COPD研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。WBP系統(tǒng)能在動(dòng)物清醒狀態(tài)下對其呼吸功能進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，精確捕捉氣道反應(yīng)性、肺容量等關(guān)鍵指標(biāo)的變化，從而深入揭示COPD的病理生理機(jī)制。此外，系統(tǒng)還配備了霧化給藥功能，使得研究人員能夠同步進(jìn)行藥物吸入實(shí)驗(yàn)，快速而準(zhǔn)確地評估藥物對COPD的治療效果。

通過應(yīng)用EMMSLink WBP系統(tǒng)，研究人員可以更加全面地了解COPD的發(fā)展過程，包括疾病進(jìn)展、氣道炎癥和氣流受限等方面的變化。這不僅有助于研究者更深入地認(rèn)識COPD，還為制定更加精準(zhǔn)和有效的治療策略提供了重要的參考依據(jù)。（需圖片）

EMMS FM用力肺功能檢測系統(tǒng)在肺功能檢測領(lǐng)域展現(xiàn)出了卓越的性能和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。該系統(tǒng)專為慢阻肺（COPD）、肺間質(zhì)、肺氣腫、肺纖維化、矽肺、急性肺損傷、機(jī)械通氣型肺損傷等研究而設(shè)計(jì)，為科研人員提供了精準(zhǔn)的肺功能檢測手段。

同時(shí)，FM系統(tǒng)具備全面的生理指標(biāo)參數(shù)檢測能力，如FEV(x)、FEF(x)、FVC、FRC、MMEF、TLC等，能夠全面反映肺功能狀態(tài)，為疾病的診斷和治療提供有力依據(jù)。

此外，FM系統(tǒng)還兼具彌散功能和氣道阻力及順應(yīng)性測量等功能，可廣泛應(yīng)用于各種臨床前研究。其精準(zhǔn)度和穩(wěn)定性都得到了廣大用戶的認(rèn)可和好評。（需圖片）

COPD造模過程中，往往需要模擬肺部疾病的病理生理過程，特別是肺部炎癥和氣流受限的特征。通過使用上海玉研儀器肺部霧化給藥裝置，研究人員可以精確地模擬藥物在肺部的作用過程，觀察藥物對肺部炎癥和氣流受限的影響，從而更準(zhǔn)確地評估藥物的療效和安全性。

肺部霧化給藥裝置具有可定量、直接肺部霧化給藥的特點(diǎn)，能夠確保給藥量的準(zhǔn)確性和一致性，提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和可靠性。（需圖片）

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