文獻(xiàn)速遞 | IF=15.1玉研肺部霧化給藥裝置助力彈性蛋白酶納米復(fù)合物消滅肺癌細(xì)胞

肺癌是當(dāng)異常細(xì)胞在肺部以不受控制的方式生長(zhǎng)時(shí)開(kāi)始的一種癌癥。它是一個(gè)嚴(yán)重的健康問(wèn)題，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的傷害和死亡,是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因，在男性和女性中的死亡率均為最高。目前，靶向治療是一種以干擾癌變或腫瘤增生所需的特定分子來(lái)阻止癌細(xì)胞增長(zhǎng)的一種藥物療法，對(duì)于腫瘤中發(fā)現(xiàn)特定基因突變或生物標(biāo)志物的患者來(lái)說(shuō)，是一種重要的選擇。

最近，北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院林志強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在國(guó)際知名期刊Chemical Engineering Journal（IF=15.1）發(fā)表一篇題為“An elastase nanocomplex with metal cofactors for enhancement of target protein cleavage activity and synergistic antitumor effect”的文章。該研究借鑒金屬離子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和活性的方式，采用基于金屬輔因子的方法，以胰腺?gòu)椥缘鞍酌?/span>(PPE，ELANE 同系物)為模型藥物，增強(qiáng)靶蛋白裂解和抗腫瘤效應(yīng)。作者體外開(kāi)發(fā)并優(yōu)化了一種具有增強(qiáng)裂解活性的彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN)，借助玉研肺部霧化給藥裝置定量靶向給予到小鼠肺部，CAEN阻止了PPE在生物環(huán)境中的降解，并有效地將其傳遞給腫瘤細(xì)胞。通過(guò)有效裂解跨膜蛋白CD95(與游離PPE相比具有更高的特異性)，CAEN在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的凋亡。

 CAEN能夠保護(hù)和穩(wěn)定PPE蛋白的活性

CAEN主要通過(guò)無(wú)創(chuàng)霧化吸入進(jìn)入肺組織，實(shí)現(xiàn)肺組織特異性蛋白藥物傳遞(圖1)。在腫瘤細(xì)胞中，從CAEN釋放的PPE與Mn²⁺嵌合體特異性裂解腫瘤細(xì)胞的跨膜蛋白CD95，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而且釋放的Mn²⁺能有效增強(qiáng)肺部腫瘤組織的局部免疫反應(yīng)。

圖 1 彈性蛋白酶納米復(fù)合物(CAEN)

由于血液中存在多種絲氨酸蛋白酶，因此在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)抑制PPE的活性。作者為了驗(yàn)證CAEN對(duì)血清的敏感性，在不同細(xì)胞系中使用了含或不含胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示。CAEN組在使用含或不含血清培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性作用。

圖 2 不同制劑（含或不含血清）處理后的細(xì)胞存活率

上述實(shí)驗(yàn)表明設(shè)計(jì)的CAEN能夠穩(wěn)定PPE的活性，防止其受到血清中蛋白酶抑制劑的抑制，達(dá)到完全的抗腫瘤效果。這充分說(shuō)明金屬離子的礦化改性策略有望提供一種保護(hù)PPE活性的方法，CAEN的生物礦化作用為這類(lèi)功能蛋白在抗腫瘤治療中的有效活性提供了納米屏障。

CAEN可特異性裂解CD95促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

為了驗(yàn)證不同制劑組裂解CD95的能力，作者純化了MBP-CD95蛋白并進(jìn)行切割實(shí)驗(yàn)。首先，將不同制備組與MBP-CD95蛋白孵育30min，結(jié)果見(jiàn)圖3兩組之間的差異在于PPE組完全裂解WBP-CD95，而CAEN組僅選擇性裂解CD95蛋白。因此，彈性蛋白酶與錳離子的生物礦化復(fù)合物可以實(shí)現(xiàn)CD95 蛋白的特異性裂解。

圖 3 不同制劑與MBP-CD95體外切割效果驗(yàn)證

作者在B16-F10腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，CAEN治療組發(fā)生凋亡的腫瘤細(xì)胞比例最顯著，表明CAEN具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

圖 4 不同制劑凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析

上述實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了CAEN裂解靶蛋白的潛力及其抗腫瘤作用。

CAEN可提高藥物的輸送效率和肺部滯留時(shí)間

研究表明，與靜脈給藥相比，吸入和遞送治療藥劑可對(duì)局部惡性腫瘤組織實(shí)現(xiàn)更好的治療效果，并降低不相關(guān)的全身效應(yīng)的可能性。在文章中，作者使用玉研儀器公司的肺部霧化給藥裝置（YAN-30012）對(duì)小鼠肺部定量輸送CAEN制劑。

為了驗(yàn)證霧化裝置能夠成功給藥，作者使用考馬斯亮藍(lán)溶液(CBB)作為指示劑來(lái)證明藥物可以有效地進(jìn)入小鼠的肺組織。圖6可以觀察到小鼠肺組織中有明顯量的CBB液，主要均勻分布在氣管、支氣管。因此，肺部霧化給藥有望有效實(shí)現(xiàn)納米粒子的局部遞送和組織器官的特異性治療。

圖 5 考馬斯亮藍(lán)溶液已被霧化吸入

為了檢驗(yàn)CAEN在肺部的滯留，作者使用Cy7熒光染料標(biāo)記的PPE和CAEN進(jìn)行肺部霧化給藥，并取出肺組織用于熒光成像觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用肺部霧化給藥方法可使CAEN均勻進(jìn)入肺組織。

圖 6 小鼠霧化吸入PPE和CAEN后不同時(shí)間點(diǎn)的熒光成像結(jié)果

此外，作者還評(píng)估了肺部霧化給藥后不同制劑在肺組織中的跨粘膜吸收行為。吸入PPE-Cy7和CAEN-Cy7后24小時(shí)，處死小鼠，采集肺進(jìn)行熒光成像。熒光成像如圖所示，在用CAEN-Cy7處理的肺中觀察到更強(qiáng)和更深的熒光分布，表明礦化納米顆粒作為載體表現(xiàn)出優(yōu)異的滲透和保留能力，能夠顯著改善生物大分子蛋白的跨粘膜通透性和截留率。

圖 7 各組離體器官和肺組織切片熒光成像結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與游離蛋白相比，CAEN能提高細(xì)胞攝取效率，并延長(zhǎng)蛋白在局部組織中的保留時(shí)問(wèn)。

體內(nèi)遞送CAEN可抑制腫瘤生長(zhǎng)

為驗(yàn)證CAEN的抗腫瘤作用，C57BL/6小鼠經(jīng)尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞，形成肺癌模型。在第5、9、13、17天使用玉研肺部霧化給藥裝置給小鼠肺部給藥，進(jìn)行局部抗腫瘤治療。在第5、13和21天，解剖小鼠并收集其肺組織。隨后，作者計(jì)數(shù)了小鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移灶（圖10）。CAEN組在抗腫瘤治療期間保持了優(yōu)異的治療效果，無(wú)明顯轉(zhuǎn)移。PPE組出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)移灶，這可能是由于PPE氣霧劑吸入無(wú)法有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，使肺組織表面的彈性纖維降解，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

腫瘤組織H&E染色顯示（圖11），CAEN給藥組小鼠組織切片中癌細(xì)胞較少，而PBS組和PPE組中癌細(xì)胞較多。

圖 8 小鼠肺部給藥示意圖

圖 9 使用PBS、PPE和CAEN治療的小鼠肺組織圖像和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量

圖 10 肺組織轉(zhuǎn)移灶的H&E染色組織學(xué)檢查

健康小鼠經(jīng)同樣處理后（圖12），發(fā)現(xiàn) PPE處理組對(duì)健康小鼠肺組織造成炎性損傷，CAEN處理組和PBS處理組無(wú)明顯變化。PPE蛋白對(duì)肺組織的損傷有利于腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，這也解釋了PPE治療組小鼠在第21天出現(xiàn)嚴(yán)重腫瘤病變的原因。

圖 11 未接種腫瘤的小鼠經(jīng)同樣處理后肺組織的H&E染色結(jié)果

TUNEL染色（圖13）證實(shí)CAEN有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中CAEN組CD8+T細(xì)胞比例最高，提示其在肺腫瘤組織中有高度浸潤(rùn)，有利于殺傷腫瘤細(xì)胞。

圖 12 各組小鼠肺組織TUNEL和CD8+T細(xì)胞染色結(jié)果

CAEN可以通過(guò)肺部霧化給藥實(shí)現(xiàn)器官特異性遞送，擴(kuò)大了PPE蛋白的應(yīng)用范圍。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CAEN在錳離子的輔助下，可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活腫瘤組織的局部免疫反應(yīng)。

結(jié)論

豬胰腺?gòu)椥缘鞍酌?/span>(PPE)作為一種新型的抗腫瘤蛋白藥物，具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力。然而，由于其固有的缺陷，PPE在腫瘤治療中的應(yīng)用受到限制，在本研究中，作者設(shè)計(jì)并制備了一種切割活性增強(qiáng)的彈性蛋白酶納米復(fù)合體(CAEN)，該復(fù)合體含有Ca²⁺、PPE及其輔因子(Mn²⁺)以實(shí)現(xiàn)CD95 蛋白的特異性切割。CAEN不僅有效地保護(hù)和穩(wěn)定了PPE蛋白的活性，而且在不同類(lèi)型的癌細(xì)胞中也表現(xiàn)出有效的殺傷作用。通過(guò)玉研肺部霧化給藥裝置，有效實(shí)現(xiàn)了納米粒子CAEN在小鼠肺部的定量精準(zhǔn)靶向遞送和肺部組織器官的特異性治療效果。CAEN中金屬離子的釋放影響了肺部腫瘤細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高和線粒體損傷。結(jié)合Mn²⁺的免疫激活功能，CAEN在體內(nèi)外均能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有良好的生物安全性。總之，該研究為蛋白質(zhì)藥物在抗腫瘤治療中的應(yīng)用提供了有效的研究思路。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

玉研儀器肺部霧化給藥裝置(Microsprayer Aerosolizer)也稱(chēng)作氣管內(nèi)霧化給藥裝置，是專(zhuān)門(mén)為小鼠、大鼠、豚鼠等小動(dòng)物設(shè)計(jì)，可精確進(jìn)行氣管內(nèi)霧化給藥的裝置。可將定量液體通過(guò)集成在不銹鋼毛細(xì)插管中的氣溶膠霧化微噴頭霧化，毛細(xì)插管可深入動(dòng)物至支氣管分叉處，實(shí)現(xiàn)氣管內(nèi)定量霧化成氣溶膠給藥。相較于傳統(tǒng)口服或注射給藥，藥物可直接作用于肺部，適用于肺部生理、病理、藥理學(xué)研究，按給藥的狀態(tài)不同還可分為液體給藥以及干粉給藥。

產(chǎn)品特點(diǎn)

l 適用于小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等小動(dòng)物，也可走制大動(dòng)物專(zhuān)用款;

l 氣管內(nèi)直接給藥，無(wú)首關(guān)消除，藥物全身效應(yīng)小

l 藥物可為液體或干粉，滿足不同需求

l 微量精確給藥，最小藥物用量25uL(液體)

l 可用于溶液、小細(xì)胞懸浮液、均質(zhì)懸濁液、粘度較低的乳濁液、干粉等給藥

l 90%藥物霧化直徑<30um(液體)，可均分布于大小肺部組織中

l 使用方便，安全穩(wěn)定，采用不銹鋼材質(zhì)，堅(jiān)固穩(wěn)走耐腐蝕

l 可用于吸入毒理學(xué)、空氣生物學(xué)、生物危害測(cè)試、吸入免疫、吸入治療、藥物研究、環(huán)境評(píng)價(jià)、危害評(píng)估和醫(yī)學(xué)防護(hù)等諸多領(lǐng)域

玉研儀器肺部霧化給藥裝置可提供中化所專(zhuān)業(yè)粒徑分布測(cè)試報(bào)告，從報(bào)告中可以看到90%藥物霧化直徑<30um(液體)。

霧化效果展示（GIF）

肺部霧化給藥的優(yōu)勢(shì)

1. 可直接將藥物定量遞送至肺部或以肺部為媒介。實(shí)現(xiàn)局部或系統(tǒng)疾病的治療

2. 肺部給藥可以避免肝首過(guò)效應(yīng)，降低給藥劑量，減少不良反應(yīng)

3. 肺部給藥可以快速吸收藥物進(jìn)入體循環(huán)，保持藥物的生物活性，適用于蛋白質(zhì)多肽的給藥

4. 肺部給藥是一種新型的、更有效的促進(jìn)藥物肺內(nèi)均勻分布的給藥方法，只需單次霧化，且劑量能準(zhǔn)確控制

玉研肺部給藥裝置通堵裝置

通堵裝置是一種玉研儀器最新設(shè)計(jì)，用于清除肺部給藥裝置針頭管道內(nèi)的堵塞物，和保證肺部給藥裝置內(nèi)管道暢通的工具。

l 主要功能：通堵器的設(shè)計(jì)目的是清除肺部給藥裝置針頭管道內(nèi)的堵塞物，如藥液殘留、黏附的微?；蚱渌s質(zhì)。確保藥物能夠順利到達(dá)肺部，達(dá)到預(yù)期的治療效果。

l 預(yù)防堵塞：除了清除已有的堵塞，通堵器還可以用于日常維護(hù)，定期使用可以防止藥液殘留在管道內(nèi)凝固，預(yù)防未來(lái)的堵塞問(wèn)題。

l 易于使用：通堵器設(shè)計(jì)為手持工具，操作簡(jiǎn)便，用戶可以方便地使用它進(jìn)行日常的設(shè)備維護(hù)，不需要復(fù)雜的操作。

l 清潔方便：采用高性能PEK（聚醚酮）材質(zhì)，可以使用常見(jiàn)的高溫高壓蒸汽滅菌或者酒精消毒，使其易于清潔和消毒，確保在使用過(guò)程中不會(huì)引入新的污染物。

拓展閱讀

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